2.1.5.7 臭氧消毒柜
2.1.5.7.1 目 的
測定臭氧消毒柜(下簡稱消毒柜)對物體表面上微生物的殺滅效果，以驗證其殺菌性能是否符合原設(shè)計規(guī)定。
2.1.5.7.2 試驗器材
(1) 金黃色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大腸桿菌( 8099 )、銅綠假單胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )懸液和脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。
(2) 染菌載體(10mm × 10mm，以布片或玻璃片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。
(3) 臭氧采樣裝置和濃度分析儀。
(4) 細菌定量殺滅試驗用器材( 見 2.1.1.7，2.1.1.9 )。
(5) 脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗用試液、培養(yǎng)基和器材(見 2.1.1.10 )。
(6) 溫度與濕度計。
2.1.5.7.3 臭氧濃度測定
(1) 儀器測定:臭氧濃度可用臭氧分析儀測定。操作按儀器使用說明書規(guī)定進行。
(2) 化學(xué)滴定法測定:參考本規(guī)范理化鑒定實驗技術(shù)。
2.1.5.7.4 殺滅微生物試驗操作程序
臭氧消毒柜的臭氧發(fā)生器臭氧發(fā)生量一般不可調(diào)，故試驗時設(shè) 3 個作用時間組［時間分組見2.1.1.7.3（1）］。
（1）細菌和真菌殺滅試驗
①按 2.1.1.2 所示相關(guān)方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增設(shè)其他試驗微生物。
②因臭氧在柜內(nèi)擴散慢，分布不易均勻，故物品在柜內(nèi)應(yīng)擺放至使用說明書中規(guī)定的最高裝載量(滿載)，以盡量接近實際應(yīng)用時的情況。
③以 2 片菌片一組，置一無菌平皿中，勿重疊。試驗時，將放有菌片的平皿蓋打開，分層布放，每層內(nèi)、中、外各點分別放一組樣本。
④按照使用說明書要求，調(diào)節(jié)柜內(nèi)溫度與相對濕度，并記錄備查，然后開啟臭氧發(fā)生器進行消毒。
⑤消毒至規(guī)定時間，取出菌片，按 2.1.1.3 所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。對白色念珠菌的殺滅試驗，用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，對黑曲霉菌的殺滅試驗，用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基，其他方法和步驟均與細菌殺滅試驗相同。因臭氧氣體熏蒸，載體吸收的量少、分解快，可不必進行去除殘留臭氧的處理。每組試驗重復(fù) 3 次。
⑥將未消毒的菌片2片，放置于消毒碗柜外室溫下。待試驗組消毒完畢后，同時進行活菌培養(yǎng)計數(shù)檢測。取本次試驗同批的 PBS 接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為陰性對照。
[對未固定裝于消毒箱內(nèi)的臭氧發(fā)生器(如冰箱臭氧消毒器)，其殺菌效果鑒定，可按其用途，在相應(yīng)的密閉柜內(nèi)進行。柜的大小應(yīng)與所設(shè)計的殺菌有效范圍相近]。
（2）脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗
①按 2.1.1.10.3 所示方法制備脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。若無特殊要求，用玻片為載體。
②在消毒碗柜滿載的情況下，將干燥的染有脊髓灰質(zhì)炎病毒的載體置滅菌平皿內(nèi)，每平皿放 2 片，勿重疊。在消毒碗柜每層的內(nèi)、外兩個點各放一含染有脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的平皿(大型碗柜可在內(nèi)、中、外各放一平皿)，平皿蓋打開。
③關(guān)閉柜門，開啟電源，按原規(guī)定程序進行消毒。消毒完畢，按說明書規(guī)定的時間，打開柜門，取出平皿。將載體移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度。
④將未消毒的染有脊髓灰質(zhì)炎病毒的載體 2 片，放置于消毒碗柜外室溫下。待試驗組消毒完畢后，立即將載體移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度，作為陽性對照。
⑤陰性對照，用不含脊髓灰質(zhì)炎病毒的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以觀察培養(yǎng)基有無污染，細胞是否生長良好。
⑥試驗重復(fù) 3 次。
⑦根據(jù)各組的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分別計算其對病毒的滅活對數(shù)值。
2.1.5.7.5 評價規(guī)定
對細菌及其芽孢和真菌，在3次試驗中，所設(shè)陽性對照組回收菌量在5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照無菌生長，試驗組中每次試驗細菌及其芽孢和真菌的殺滅對數(shù)值均≥3；對脊髓灰質(zhì)炎病毒，在 3 次試驗中，所設(shè)陽性對照組，脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度達 105 (TCID50)，陰性對照細胞無污染，試驗組中每次試驗病毒滴度下降 4 個對數(shù)值者，該組作用時間可作為實驗室試驗消毒合格的最短作用時間。
若陽性或陰性對照組的結(jié)果與上述要求不符，試驗作廢，重新進行。
2.1.5.7.6 注意事項
(1) 對試驗結(jié)果有懷疑時，可在試驗時同步進行臭氧濃度測定，以便作進一步的分析。
(2) 每次試驗完畢，應(yīng)充分排除消毒柜內(nèi)的臭氧氣體，勿使有臭氧殘留，以免影響隨后的試驗。
(3) 空氣中 臭氧 濃度不得超過 0.3mg/m3，臭氧吸入過多，可使人中毒，試驗場所應(yīng)保持通風(fēng)良好。
(4) 溫度和相對濕度均可影響臭氧氣體對細菌的殺滅效果，試驗時必須控制好這些條件，使其前后一致。
2.1.5.8臭氧水消毒器
2.1.5.8.1 目的
檢測臭氧水消毒器發(fā)生的臭氧水消毒劑對物品表面的消毒效果，以驗證臭氧水消毒劑對物品表面消毒的實用劑量。
臭氧水消毒劑指應(yīng)用臭氧消毒設(shè)備制備的含臭氧的水溶液，并以其作為消毒劑，用于對物品表面等的消毒。
2.1.5.8.2 試驗器材
(1) 金黃色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大腸桿菌( 8099 )、銅綠假單胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )懸液和脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。
(2) 染菌載體(10mm×10mm，以布片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。
(3) 臭氧采樣裝置。
(4) 細菌定量殺滅試驗用器材與培養(yǎng)基(見 2.1.1.7，2.1.1.9 )。
(5) 脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗用試液、培養(yǎng)基和器材(見 2.1.1.10 )。
(6) 溫度與濕度計。
(7) 500 ml塑料杯。
(8) 水流量計（1L/min～10L/min）。
(9) 不銹鋼網(wǎng)。
(10) 臭氧濃度測定用臭氧分析儀和化學(xué)滴定法用試劑、器材等。
2.1.5.8.3 臭氧濃度測定
臭氧濃度的測定方法分為化學(xué)滴定法和儀器測定法。
儀器測定法按儀器使用說明書要求進行。
（1）通過式臭氧消毒設(shè)備
測定水樣流出消毒設(shè)備后臭氧濃度由高到低的衰變曲線。測定時，若出水流量可調(diào)，設(shè) 3 個流量其中應(yīng)包括該設(shè)備的最大流量和最小流量，若出水流量不可調(diào)，則按說明書要求設(shè) 1 個流量，各流量水樣流出消毒設(shè)備后，即刻測定水樣中臭氧含量，然后再將水樣放 20℃ 水浴中，設(shè) 5個～6個時間段，分別測定水樣中臭氧含量，并繪制臭氧濃度衰變曲線。
（2）暴氣式臭氧消毒設(shè)備
測定一定容量的水體中臭氧濃度由低到高，直到臭氧濃度達飽和時的濃度變化曲線。按說明書要求，加入規(guī)定容量的水樣，通入臭氧氣體，設(shè) 5個～6個時間段（應(yīng)測出臭氧濃度達飽和時的最短時間），分別測定水樣中臭氧含量，并繪制臭氧濃度變化曲線。
2.1.5.8.4 殺滅微生物試驗操作程序
按臭氧設(shè)備制備臭氧水消毒劑的方式分為暴氣式與通過式兩類。
（1）暴氣方式臭氧消毒設(shè)備制備臭氧水消毒劑的殺滅微生物試驗
①按 2.1.1.2 所示相關(guān)方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌黑色變種芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增設(shè)其他試驗微生物。
②有專用容器者，按說明書要求向?qū)Ｓ萌萜鲀?nèi)加入規(guī)定容量的無菌蒸餾水無專用容器者，用容量≥3000ml的燒杯，盛裝3000ml無菌蒸餾水樣，調(diào)水溫至20℃±2℃
若無專用容器但需在更大容量的水樣中進行試驗者，示消毒設(shè)備狀況，按使用說明書要求調(diào)整水樣用量，并調(diào)水溫至20℃±2℃。
③將不銹鋼網(wǎng)放盛水容器底部中央，染菌布片放不銹鋼網(wǎng)表面，染菌布片上再蓋一不銹鋼網(wǎng)片。
④連接微孔擴散裝置與臭氧氣源出口，開啟臭氧消毒設(shè)備，開始消毒處理。
⑤待臭氧暴氣浸泡消毒至規(guī)定作用時間（第一個作用時間應(yīng)不少于水中臭氧達飽和濃度所需時間），取出樣片，移入含5 ml中和劑溶液的試管中，中和10 min，進行活菌計菌。
⑥試驗同時設(shè)陽性對照和陰性對照組，陽性對照用無臭氧氣體代替臭氧氣體，在水樣體積和暴氣量等相同條件下，將染菌樣片暴氣浸泡至最長作用時間，取出樣片，進行活菌計數(shù)。
⑦試驗重復(fù)3次。
⑧根據(jù)各組殺滅對數(shù)值計算結(jié)果，確定殺滅細菌繁殖體，真菌或細菌芽孢的殺滅對數(shù)值為3所需最低有效濃度和相應(yīng)的作用時間。
（2）通過式臭氧消毒設(shè)備制備的臭氧水消毒劑流動載體浸泡殺滅微生物試驗
①按 2.1.1.2 所示相關(guān)方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌黑色變種芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增設(shè)其他試驗微生物。
②將臭氧水消毒設(shè)備開機5min，使臭氧水中臭氧含量穩(wěn)定。
③取不銹鋼網(wǎng)放盛水容器底部中央，染菌布片放不銹鋼網(wǎng)表面，染菌布片上再蓋一不銹鋼網(wǎng)片。用臭氧水消毒劑沿容器壁流下，流動浸泡消毒至說明書規(guī)定作用時間，取樣檢驗。
④試驗同時設(shè)陽性和陰性對照。陽性對照組用自來水代替臭氧水消毒劑，在相同流量下流動浸泡至最長作用時間。取出樣片，進行活菌計數(shù)。
⑤取本次試驗同批的 PBS 和培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為陰性對照。
⑥試驗重復(fù)3次。
⑦根據(jù)各組殺滅率計算結(jié)果，確定殺滅細菌繁殖體、真菌或細菌芽孢的殺滅對數(shù)值為3所需最低有效濃度和相應(yīng)的作用時間。
2.1.5.8.5 脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗
(1) 按 2.1.1.10.3 所示方法制備脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。若無特殊要求，用玻片為載體。
(2) 將制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒玻片加到無菌試管中，使帶有病毒的一面向上。
(3) 將臭氧水消毒設(shè)備開機5min，使臭氧水中臭氧含量穩(wěn)定。
(4) 向含有脊髓灰質(zhì)炎病毒玻片的試管中加入1.0ml的臭氧水消毒劑，浸泡消毒至規(guī)定作用時間，取出玻片載體，移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度。
(5)將未消毒的染有脊髓灰質(zhì)炎病毒的玻片，加到1.0ml的無菌蒸餾水中，浸泡至規(guī)定消毒作用的最長時間。取出玻片載體，移入含 1ml 細胞維持液的試管中。振打后，取樣按 2.1.1.10.4 所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度，作為陽性對照。
（6）陰性對照，用不含脊髓灰質(zhì)炎病毒的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以觀察培養(yǎng)基有無污染，細胞是否生長良好。
(7) 試驗重復(fù) 3 次。
(8) 根據(jù)各組的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分別計算其對病毒的滅活對數(shù)值。
2.1.5.8.6 評價規(guī)定
對細菌及其芽孢和真菌，在3次試驗中，所設(shè)陽性對照組的回收菌量在5 × 105cfu/片～5 × 106 cfu/片，陰性對照無菌生長，試驗組中每次試驗細菌及其芽孢和真菌的殺滅對數(shù)值均≥3.00；對脊髓灰質(zhì)炎病毒，在3次試驗中，所設(shè)陽性對照組，脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度達105 (TCID50)，陰性對照細胞無污染，試驗組中每次試驗病毒滴度下降4個對數(shù)值者，該組作用時間可作為實驗室試驗消毒合格的最短作用時間。
若陽性或陰性對照組的結(jié)果與上述要求不符，試驗作廢，重新進行。
2.1.5.8.7 注意事項
對試驗結(jié)果有懷疑時，可在試驗時同步進行臭氧濃度測定，以便作進一步的分析。
